發(fā)表期刊：ACS Nano

IF：17.1

缺血性中風(fēng)是一種具有高死亡率和致殘風(fēng)險(xiǎn)的神經(jīng)功能障礙，缺氧或缺血會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙，引發(fā)一系列惡性事件，包括氧化損傷、小膠質(zhì)細(xì)胞激活、炎癥過(guò)程和神經(jīng)元死亡等。由氧化應(yīng)激和炎癥因子主要引發(fā)的血腦屏障(BBB) 損傷伴隨細(xì)胞旁通透性增加，會(huì)導(dǎo)致不受調(diào)控的血腦交換，加劇中風(fēng)。缺血性中風(fēng)導(dǎo)致BBB開(kāi)放后，藥物得以不受控地進(jìn)入大腦，這為給藥提供了契機(jī)，但同時(shí)也與試圖封閉BBB的保護(hù)性治療策略形成了矛盾。跨細(xì)胞途徑是穿透BBB并將治療藥物選擇性遞送至大腦的可行替代方案。多酚類物質(zhì)通過(guò)誘導(dǎo)保護(hù)性自噬、修復(fù)BBB損傷、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞極化、炎癥因子、凋亡相關(guān)蛋白及氧化應(yīng)激損傷等多重途徑，已成為缺血性中風(fēng)的治療方案。同時(shí)，多酚復(fù)合物含有的兒茶酚和鄰苯三酚活性基團(tuán)，能通過(guò)多種相互作用與其他物質(zhì)結(jié)合，為構(gòu)建多功能遞送系統(tǒng)提供了有利條件。

本研究開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)缺血性中風(fēng)的多層次治療策略：通過(guò)多重受體介導(dǎo)的胞吞作用穿透BBB，并利用保護(hù)性自噬對(duì)其進(jìn)行重塑，同時(shí)調(diào)控中風(fēng)后微環(huán)境。研究開(kāi)發(fā)了一種摻雜Ce的楊梅素(Myr) 低聚物衍生的納米結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體共同介導(dǎo)的BBB，并通過(guò)激活保護(hù)性自噬來(lái)調(diào)節(jié)緊密連接蛋白(TJs) 的表達(dá)，從而展現(xiàn)出修復(fù)BBB的能力。Myr低聚物骨架不僅作為靶向部分，更是繼承了Myr所有多樣化藥理活性的顯著活性實(shí)體。其對(duì)氧化損傷、M1小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子的抑制，使這一單組分納米劑兼具骨架結(jié)構(gòu)、靶向域和治療成分的多重功能。

1.PC NPs的合成與表征

采用溶膠-凝膠技術(shù)和組裝工藝制備了聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 修飾的Ce-多酚膠體納米顆粒(PC NPs)。首先選擇具有神經(jīng)保護(hù)作用的多酚類化合物Myr作為骨架成分，通過(guò)拜耳反應(yīng)合成Myr低聚物，再與PVP共組裝形成針狀納米結(jié)構(gòu)(PM NPs)，通過(guò)螯合組裝將Ce離子摻雜到PM中，獲得具有松散結(jié)構(gòu)且高穩(wěn)定性的膠體納米顆粒(PC NPs)。

2.ROS清除特性

活性氧(ROS) 和活性氮(RNS) (統(tǒng)稱RNOS) 的生成與清除失衡可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激和過(guò)度炎癥反應(yīng)，加劇缺血性損傷。與不含Ce的PM NPs相比，PC NPs具有ROS/RNS清除能力，展現(xiàn)了其潛在的多酶模擬特性，更強(qiáng)的總抗氧化能力(T-AOC) 也證明其具有突出的缺血再灌注(I/R) 疾病治療應(yīng)用潛力。PC NPs對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的清除效果同樣優(yōu)異，在抵抗H?O?誘導(dǎo)的ROS應(yīng)激時(shí)，具有最佳維持正常細(xì)胞線粒體膜電位(MMP) 的能力，通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，顯著緩解線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

3.抗氧糖剝奪/再灌注(OGD/R) 誘導(dǎo)缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的抗凋亡作用

I/R可觸發(fā)缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括興奮性毒性和神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷。在缺血狀態(tài)下，能量耗竭和離子泵功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子過(guò)量，通過(guò)釋放谷氨酸激活神經(jīng)元興奮性中毒，引發(fā)早期缺血性細(xì)胞死亡。PC NPs能有效保護(hù)細(xì)胞免受OGD/R后由興奮性毒性和氧化應(yīng)激等缺血性損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡。通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。增加NRF2及其下游氧化蛋白表達(dá)來(lái)激活NRF2/HO-1通路，減少ROS產(chǎn)生，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)并促進(jìn)氧化還原平衡。同時(shí)也能顯著降低被激活的cleaved-caspase 3(CC3)蛋白水平，保護(hù)細(xì)胞免受OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提升細(xì)胞存活率。

4.自噬激活與BBB體外保護(hù)

在缺氧/低糖條件下，缺血性中風(fēng)期間不僅神經(jīng)元需要高度激活自噬來(lái)抑制異常細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的積累，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞同樣如此。適度誘導(dǎo)自噬可防止細(xì)胞發(fā)生一系列缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

Myr具有上調(diào)自噬的能力，而Ce摻雜進(jìn)一步增強(qiáng)了PC NPs的自噬調(diào)控能力，這可能與其更強(qiáng)的抗氧化能力和更快的內(nèi)吞作用相關(guān)。氧糖剝奪/復(fù)氧處理后細(xì)胞單層及BBB完整性受損，而PC NPs顯示出腦血管修復(fù)能力，這表明PC NPs可通過(guò)抑制mTOR通路激活自噬對(duì)抗I/R損傷，從而逆轉(zhuǎn)BBB降解，修復(fù)受損屏障并增強(qiáng)神經(jīng)元存活能力。

5.BBB穿透與內(nèi)吞機(jī)制

缺血性中風(fēng)后，能量耗竭會(huì)激活一系列調(diào)節(jié)過(guò)程以適應(yīng)多重代謝紊亂，導(dǎo)致多種細(xì)胞質(zhì)膜錨定轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體上調(diào)表達(dá)。缺血性中風(fēng)后被腦內(nèi)皮細(xì)胞(BCEs) 過(guò)度表達(dá)的代表性受體有葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLU1)、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLT) 和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)，這些受體能夠幫助細(xì)胞適應(yīng)缺血/低血糖狀態(tài)下葡萄糖和鐵的異常攝取。

PC NPs可與缺氧/低血糖條件下BECs中過(guò)表達(dá)的GLUT1、SGLT1等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用，促進(jìn)其內(nèi)吞作用從而實(shí)現(xiàn)BBB穿透。BECs對(duì)PC NPs的內(nèi)化涉及多條通路：網(wǎng)格蛋白和SGLT1在內(nèi)吞過(guò)程中起主導(dǎo)作用，小窩蛋白、TfR和GLUT1也承擔(dān)重要內(nèi)化功能。多酚類物質(zhì)可通過(guò)GLUT1和SGLT1等葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體被細(xì)胞攝取，部分鑭系元素則依賴TfR內(nèi)化。顯然PC NPs同時(shí)繼承了Myr和Ce的多重特性，具備多受體介導(dǎo)的雙重內(nèi)吞途徑，以及小窩/網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)化機(jī)制，這種多元化的內(nèi)化路徑為其生物學(xué)效應(yīng)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

6.體外抗炎效應(yīng)研究

小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)減少神經(jīng)元死亡、促進(jìn)神經(jīng)再生及加速神經(jīng)功能恢復(fù)，在缺血性中風(fēng)后發(fā)揮重要作用。該細(xì)胞具有兩種表型：經(jīng)典激活型(M1促炎表型) 和替代激活型(M2抗炎表型)。二者對(duì)腦功能恢復(fù)具有相反作用，前者通過(guò)產(chǎn)生有害的促炎細(xì)胞因子加劇腦損傷，而后者可減輕局部神經(jīng)炎癥并促進(jìn)腦功能恢復(fù)。因此在腦I/R的治療過(guò)程中，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞向M2表型極化至關(guān)重要，通過(guò)促進(jìn)抗炎M2表型極化，小膠質(zhì)細(xì)胞可能恢復(fù)其他細(xì)胞的功能。PC NPs能顯著促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，以此進(jìn)一步緩解I/R導(dǎo)致的腦炎癥損傷。

7.腦I/R體內(nèi)治療效果研究

PC NPs能在中風(fēng)后高效富集于腦部，Ce摻雜賦予了PC NPs更強(qiáng)的腦組織穿透優(yōu)勢(shì)。Ce摻雜不僅通過(guò)三價(jià)與四價(jià)態(tài)間的價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)換增強(qiáng)PC NPs的抗氧化能力，還與TfR依賴的內(nèi)吞作用相關(guān)。

中風(fēng)后被動(dòng)性BBB滲漏與主動(dòng)性跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的疊加效應(yīng)進(jìn)一步提升了納米制劑的腦部灌注量。PC NPs對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，能夠減輕神經(jīng)損傷，有效逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元死亡，縮小腦梗死面積。此外，PC NPs還可以上調(diào)Bcl-2表達(dá)并抑制CC3和Bax，有效緩解I/R引發(fā)的細(xì)胞凋亡。

8.改善I/R造成的BBB損傷

BBB作為大腦的保護(hù)性屏障，能阻止有害生物和物質(zhì)侵入。I/R后BBB的完整性和功能會(huì)遭到破壞，從而加劇缺血性中風(fēng)的病理進(jìn)程并改變其轉(zhuǎn)歸。PC NPs通過(guò)抑制TJs降解，有效減輕BBB破壞，保護(hù)血管形態(tài)完整性。

9.小膠質(zhì)細(xì)胞極化調(diào)控逆轉(zhuǎn)促炎微環(huán)境

I/R后，具有高吞噬活性的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，極化為經(jīng)典的促炎M1表型和抗炎M2表型。PC NPs可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化，隨著濃度升高，PC NPs誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化的能力逐漸增強(qiáng)。此外，PC NPs能夠抑制NF-κB通路，從而逆轉(zhuǎn)I/R后的促炎微環(huán)境。